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2024-11-01详细介绍
在生命活动的代谢过程中不断产生各种自由基,其中羟自由基(?OH)是体内的活性氧,可介导许多生理变化,
羟自由基作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子,造成细胞结构和功能受损,进而导致体内代谢紊乱引起疾病,
如引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,并损伤膜结构和功能。羟自由基清除能力是样品抗氧化能力的重要指标之一,
在抗氧化类保健品和药品研究中得到广泛应用。
羟自由基清除率检测试剂盒(Fenton微板法)又称羟自由基清除能力检测试剂盒或羟自由基检测试剂盒,其检测原理是
H2O2/Fe2+ 通过Fenton反应产生羟自由基,并将Fe2+氧化为Fe3+,导致红色的邻二氮菲-Fe2+氧化为无色的邻二氮菲-Fe3+
,使邻二氮菲-Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失,可通过酶标仪测定530~540nm处吸光度的变化,据此可计算出羟自由基的
含量变化,即可计算出样品的羟自由基清除率或清除能力,主要用于植物组织、血清、血浆等样本。该试剂盒仅用于科研领域,
不适用于临床诊断或其他用途。
操作步骤(仅供参考):
自备材料:
1、蒸馏水
2、电子天平、研钵或匀浆器、离心管或试管
3、低温离心机、恒温箱或水浴锅、酶标仪、酶标板
操作步骤(仅供参考):
1、准备样品∶
①植物样品︰取1g植物组织或水果中层果肉,加入2.5ml PAL Lysis Buffer,冰浴情况下充分捣碎研磨或匀浆,4℃ 10000r/min
离心15~20min,留取上清液,-20℃冻存,用于苯丙氨解氨酶的检测。
②血浆、血清和尿液样品︰血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定,-20℃冻存,用于苯丙解氨的检测。
③细胞或组织样品∶取恰当细胞或组织裂解液,如果有必要需进行适当匀浆,4℃ 10000r/min离心15~20min,取上清液,
-20℃冻存,用于苯丙酸解氨酶的检测。④高活性样品︰如果样品中含有较高活性的苯丙解氨酶,可以使用蒸馏水或PAL
Lysis Buffer稀释进行恰当的稀释。
2、PAL加样∶
取96孔板,按照下表设置对照孔、测定孔,溶液应按照顺序依次加入,并
注意避免产生气泡。如果样品中的PAL活性过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定,样品的检测最好能设置2平行孔,
求平均值。
加入物(μl)对照孔测定孔
蒸馏水150100
待测样本5050
PAL Assay Buffer-50
3、PAL检测︰
以对照孔为对照(调零),酶标仪立即测定290nm处测定孔的吸光度(记为 A测定0);40℃准确孵育1h,立即加入10μl PAL终止
液终止反应(备选方案),以对照孔为对照调零,酶标仪立即测定290nm处测定孔的吸光度(记为A测定1)。
注意︰加入PAL终止液终止反应为非必须步骤,可37℃准确孵育1h后直接以对照孔为对照调零,酶标仪立即测定290nm处测定
孔的吸光度。
注意事项∶
1、待测样品中不能含有酶抑制剂,同时需避免反复冻融。
2、获得上清液为PAL酶液,应尽快检测,亦可-20°℃保存。
3、如果没有可测定紫外区的酶标仪和酶标板,也可以使用紫外分光光度计和石英比色皿,但应注意比色杯的最小检测体积。
4、每次检测指标不宜过多,否则操作时间不一,有可能导致样本间的差异。5、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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