RAPA3G Probe qPCR MasterMix试剂

RAPA3G Probe qPCR MasterMix试剂将热启动 RAPA3G

DNA 聚合酶、反应 Buffer、dNTP 染料等试剂预混在一起，

是一种 2×浓度的单组分预混试剂。该制品不含有 ROX 校正

染料，适用于各种荧光标记探针，并且适用于各种定量 PCR

机型。优化的反应缓冲液，使得该制品可用于单重及多重的

探针法定量 PCR。

制品中的 RAPA3G DNA 聚合酶为第三代 DNA 聚合酶，

其具有最高的杂质耐受性，其对乙醇、胍盐、肝素、血清、

植物多糖多酚具有的耐受性，因此可用于粗样品的直接

定量 PCR 检测(Direct PCR)。该酶经化学法修饰，在 50℃

以下 100%无活性，只有 95 度条件下加热 5min 后才能

恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制非特异性 PCR 扩

增，极大的提高了 PCR 扩增特异性。

 由于 RAPA3G DNA 聚合酶对 dUTP 具有的识别能

力，该制品中的 dTTP 核酸碱基被 dUTP 所取代，因此

扩增产物均包含 dUTP，在配合热敏 UDG（该酶在 95℃热

变性 5min 后不可逆失活，不影响后续 PCR 反应）的条件下

能达到最佳的防污染能力。在 10e5 copies 污染物的测试条

件下，Ct 推迟 15 个以上（污染去除能力>99.997%）。

包装

2×RAPA3G Probe MasterMix (with UDG)

A2262A 1 ml

A2262B 25 ml

储存：-20℃可保存 2 年。短期使用可放置 2-8℃，保存 3 个

月。如出现白色沉淀溶解后使用，不影响反应性能。该试剂

经 30 次冻融后性能无下降，因此不使用时请置于-20℃避光

保存。

RAPA3G DNA 聚合酶对抑制物耐受性

SDS 0.01% Serum 2%

EtOH 5% Plasma Citrate 2%

Heparin 0.1IU/ml Gua SCN 0.25%

Hematin 30μM Trizol 0.5%操作方法

1、按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系：

 终浓度

2×RAPA3G Probe MasterMix(with UDG) 10 μl 1×

Primer F1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM

Primer R1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM

Probe1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM

其它引物和探针 X

DNA 模板 0.5~2 μl

ddH2O Up to 20 μl

2. 进行 Real-Time PCR 反应,通常采用两步法，程序如下：

Stage 1 25℃ 2 min 去污染

Stage 2 95℃ 5 min 热启动

Stage 3

40 循环

95℃ 5 s 变性

60℃ 30 s 收集信号 退火/延伸

注意：退火延伸温度可在 55-65℃调整

3. 在多数情况下，采用两步法程序可获得理想的扩增效果，

在无法达到预期理想效果的情况下，也可采用三步法 PCR

程序，程序如下：

Stage 1 25℃ 2 min 去污染

Stage 2 95℃ 5 min 热启动

Stage 3

40 循环

95℃ 5 s 变性

55℃ 10 s 退火

72℃ 30 s 收集信号 延伸

4. 反应结束后确认 Real-Time PCR 的扩增曲线和标准曲

线。R Gre

注意：消化污染步骤中的温度设置可在 25-37℃之间均可，无显著

差异，但高于 42℃以上的温度会导致热敏 UDG 消化能力急剧下降。

恒温扩增使用策略及实例展示

应用实例1：A3825-01 红黄变色反应（肉眼观察）

以 体外转录 RNA 为模板，1-6分别为1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC为ddH2O为模板。 上图为加样结束反应起始前，下图为 65 度反应 30min 后。

应用实例2：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物组进行的LAMP测试。Bst4.0 SYBR Green试剂可在标准定量PCR仪或恒温荧光仪上进行反应。以体外转录RNA为模板，1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应25min的检测结果，可以看到检测反应<20min(达平台期)。

应用实例3： 用 LP1002引物组进行的LAMP测试。OG变色法为终点变色策略，在反应结束后，倒置反应管，溶解管盖上染料后，阳性样本呈现出醒目的绿色，阴性表现出橙色，区分明显。且该方法不受样本类型限制，杂质耐受性很好。以体外转录RNA为模板，1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应20min后检测结果。

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