RAPA3G SYBR Green qPCR Mix试剂

RAPA3G SYBR Green qPCR Mix试剂本制品是采用 SYBR Green 嵌 合 荧 光 法 进 行

Real-Time PCR 的专用试剂，本 SYBR Green qPCR Mix

将化学修饰的热启动 RAPA3G DNA 聚合酶、反应 Buffer、

dNTP、SYBR Green 染料等试剂预混在一起，是一种 2×浓

度的单组分预混试剂。该制品配有单独的 ROX 内参染料，

可用于需要 ROX 进行孔间校正的定量 PCR 仪。

RAPA3G DNA 聚合酶为第三代 DNA 聚合酶，其具有最

高的杂质耐受性（对乙醇、胍盐、肝素具有的耐受性），

因此对于纯度较差的 DNA 模板，该 Mix 仍然可以获得理想

的实验结果。RAPA3G DNA 聚合酶为化学法修饰的 HotStart

版本，其在 50℃以下 100%无活性，只有 95℃条件下加热

5min 后才能恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制

非特异性 PCR 扩增，极大的提高了 PCR 扩增特异性。该试

剂盒的反应缓冲液，可在宽范围中得到良好的扩增结

果、检测灵敏度更高、信号更强。

包装

规 格

2×RAPA3G SYBR

Green qPCR Mix

50×ROX Dye

1ml （A2250A） 1 ml 200 μl

5ml （A2250B） 1 ml×5 200 μl

储存：

请避光置于-20℃以下可保存３年。该试剂经 30 次冻融后性

能无下降，因此不使用时请置于-20℃避光保存。操作方法

1. 根据机型选择步骤 A 或 B

A: 需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的 Real-Time

PCR 仪，包括：ABI PRISM7900HT, 7300/7500/7500 Fast

Real-Time PCR (Applied Biosystems)；Mx3000P

(Stratagene)等。按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系：

 终浓度

2×RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×

50×ROX Reference Dye 0.4 μl 1×

PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM

PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM

DNA 模板 0.5~2 μl

ddH2O Up to 20 μl

注意：引物用量有时可提高到 0.8 μl 以提高扩增效率。

B:无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的 Real-Time

PCR 仪，包括：LightCycler (Roche Diagnostics)； CFX96

Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博

日)等。按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系：

 终浓度

2×RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×

PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM

PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM

DNA 模板 0.5~2 μl

ddH2O Up to 20 μl

2. 进行 Real-Time PCR 反应,通常采用两步法，程序如下：

 Stage 1: 95℃ 5min*

 Stage 2: 95℃ 10s

60℃ 20s 40 cycles

 Stage 3: Dissociation analysis

注意：由于该酶为化学修饰的热启动 RAPA3G DNA 聚合酶，必须于 95℃

加热 5min 才能恢复酶的活性，该热启动步骤不能缩短时间。

3. 反应结束后确认 Real-Time PCR 的扩增曲线、融解曲线

和标准曲线。R

恒温扩增使用策略及实例展示

应用实例1：A3825-01 红黄变色反应（肉眼观察）

以 体外转录 RNA 为模板，1-6分别为1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC为ddH2O为模板。 上图为加样结束反应起始前，下图为 65 度反应 30min 后。

应用实例2：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物组进行的LAMP测试。Bst4.0 SYBR Green试剂可在标准定量PCR仪或恒温荧光仪上进行反应。以体外转录RNA为模板，1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应25min的检测结果，可以看到检测反应<20min(达平台期)。

应用实例3： 用 LP1002引物组进行的LAMP测试。OG变色法为终点变色策略，在反应结束后，倒置反应管，溶解管盖上染料后，阳性样本呈现出醒目的绿色，阴性表现出橙色，区分明显。且该方法不受样本类型限制，杂质耐受性很好。以体外转录RNA为模板，1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应20min后检测结果。

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