如何解决HL-60细胞生长慢及培养方法

HL-60细胞背景简介

HL-60细胞是通过白细胞分离术从一名患有急性早幼粒细胞白血病的 36 岁白人女性的外周血中分离出来的早幼粒细胞。 HL-60 自发分化，丁酸盐、次黄嘌呤、佛波醇肉豆蔻酸（PMA，TPA）、DMSO（1% to 1.5%）、放线菌素D和视黄酸可以促进分化。细胞表现出吞噬活性，并对趋化刺激有响应。致癌基因myc表达阳性。HL-60人急性早幼粒白血病细胞系可用于免疫紊乱和免疫学研究。

HL60细胞属于急髓白血病M3细胞株,稳定表达t（15，17）染色体核型以及PML融合基因，细胞总体形态为圆形，细胞膜清晰，细胞质呈多颗粒状。

ATCC细胞库HL-60细胞图片

细胞库HL-60细胞图片

HL-60细胞培养实验准备

提前开启紫外照射30min消毒灭菌，工作台开灯通风10min，用75%酒精擦拭台面。

器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头（白色0-10ul；黄色20-200ul；蓝色100-1000ul）、滤器、吸管、多孔培养皿、6cm皿、10cm皿，培养瓶等。

试剂：IMDM培养液、缓冲液、PBS、消化液、血清、抗生素。

HL-60细胞培养条件

形态特征：淋巴母细胞样，悬浮生长

培养基: 80%IMDM+20%FBS +PS

生长条件：气相：95%空气+5%二氧化碳；温度：37℃

传代方法：1:2至1:4，每周 3次

冻存条件：无血清冻存液（或者冷冻保存液：90%血清，10%DMSO，现用现配），液氮储存

HL-60胞收货注意事项

1.收货时需镜下拍照（看密度、状态）

2.静置后需镜下拍照（看整体密度）

a.如密度50%以下，建议换液并竖瓶培养

b.如密度50%-80%，建议换液培养，隔天观察密度

c.如密度90%，建议传代

3.换液及传代处理前，培养瓶竖着放置至少半小时（使细胞沉到瓶底）；收集上清，必须将瓶内所有培养基（70ml）全部收集！并用PBS（10ml）润洗瓶底并收集!离心转速为1000rpm，5min。

HL-60细胞养操作步骤

HL-60细胞复苏方法

1.将含有1 mLHL-60细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀；

2.在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后轻轻吹匀；

3.将所有HL-60细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）；

4.第二天换液并检查HL-60细胞密度。

HL-60细胞传代方法

如果HL-60细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

方法一：收集HL-60细胞，1000RPM条件下离心3-5min分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:4的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余HL-60细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

HL-60细胞冻存方法

待HL-60细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例

a.收集HL-60细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，然后进行细胞计数。

b.根据HL-60细胞数量对应加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c.将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

HL-60是⽬前已⽤于科学研究的⼈类⽩⾎病细胞系，最初是分离⾃⼀名36岁的⼈类⼥性急性早幼粒细胞⽩⾎病患者。

HL-60细胞应用特性

HL-60细胞以悬浮培养的形式在含有营养和抗⽣素的培养基中持续增殖，倍增时间约为 36 ⾄ 48 ⼩时。HL-60 细胞表现出嗜中性早幼粒细胞（neutrophilic promyelocyticmorphology） 形态，随后进⾏的评估则指出其出⾃成熟的急性⾻髓性⽩⾎病。HL-60细胞通过在细胞表⾯表达的转铁蛋⽩及胰岛素受体进⾏增殖。如果从⽆⾎清培养基中除去转铁蛋⽩或胰岛素受体其中⼀项， HL-60 细胞的增殖就会⽴即停⽌。通过⼆甲基亚砜或维A酸的化合物，可以诱导其分化为成熟的粒细胞;⽽⾻化三醇、佛波醇-12-⼗四烷醯-13-⼄酸酯及颗粒⽩⾎球-巨噬细胞集落刺激因⼦等的化合物，则可以分别诱导HL-60细胞分化为单核细胞、巨噬细胞样或嗜酸性粒细胞表型。

HL-60细胞系科研用途

HL-60细胞可以⽤作研究⽣理学、药理学和病毒学因素对髓样分化的影响。HL-60细胞模型已经应⽤于研究DNA拓扑异构酶 IIα 和 IIβ 对细胞分化和凋亡的影响，并且特 别适⽤于介电泳研究。此外，研究⼈员已使⽤HL-60细胞来研究细胞内的钙是否在活性氧诱导的胱天蛋⽩酶激活中发挥到作⽤。HL-60细胞及衍⽣的分化细胞，它们的染⾊质和基因表达谱研究是近年进⾏的研究。

如何养好HL-60细胞经验分享

1.细胞形态观察。细胞膜是每天必须观察的，看是否清晰, HL60细胞的死亡往往是从细胞膜的破裂开始的，早期的表现就是细胞膜某一点出现欠完整或者毛发影。

2.HL-60细胞在高密度下状态比较好，细胞状态好时会吸收一些细胞碎片；

3.低密度时细胞状态很差，传代比例要控制，当培养密度达到1x106/mL左右时可传代，细胞状态不好时后面传代可以不用离心；

4.DMSO会对HL-60刺激分化，建议复苏马上离心去除DMSO；

5.悬浮细胞对血清要求高，选用优质血清培养；

6.培养过程中尽量不动或少动培养瓶。

7.HL60细胞往往会有"抱团" 现象，抱团生长或死亡，勤换液或传代，尽量避免细胞抱团。

8.HL60细胞生长迅速，强烈建议用较大的培养瓶养，用小瓶养的话，换液不及时,很容易死亡。HL60细胞的生长速度一般为2天左右就需要传代。

9.HL60细胞对胎牛血清高度依赖。培养液PH应调为7.20-7.40之间。

10.防污染。HL60细胞生长迅速，较少发生污染，但常规措施应该做好。比如无菌操作，酒精消毒等，培养瓶口建议过火，包括瓶盖，应过火4秒左右。

11.冻存。-20℃小时, -80℃过夜，液氮长期保存。强烈建议液氮长期保存，尽量不要在-80℃长期保存，死亡率很高。

12.复苏。调节水浴箱温度为42°C，并提前在试管内放置10倍培养液，使培养液温度与室温一致。1分钟内融化细胞（禁止摇晃冻存管），移取至试管内，动作要轻，从试管管底开始慢慢，上提移液管，使细胞在培养液内分布均匀，离心，洗2次。

HL-60细胞培养常见问题

1.HL-60细胞生长慢、状态差怎么办

当细胞传代后生长速度慢且状态不佳时，可竖着培养直到培养基变黄，待细胞密度起来后，状态会有所好转。

同时，若HL-60细胞状态很差，可采用半换液的方式：

以T25瓶子为例，瓶子里有5mL培养基，竖起瓶子静置一段时间（竖瓶前拍拍瓶子，让轻贴底部的细胞团浮起来），待细胞沉底（肉眼观察细胞沉底情况），小心吸出2.5mL的培养基，转移到离心管，离心1000rpm 3~5min，用2.5mL新鲜培养基重悬后再放回原瓶。

2.HL-60细胞什么时候传代

HL-60细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养，

3.HL-60细胞贴壁吗

HL-60细胞是悬浮细胞，不是贴壁细胞。

4.HL-60细胞用什么培养基

HL-60细胞培养基是80%IMDM+20%FBS +PS

5.HL-60细胞致瘤吗

Yes, in nude mice（subcutaneous myeloid tumors） .Yes，in semi-solid media。

6.HL-60细胞受体表达情况

complement, expressed;Fc, expressed。

7.HL-60细胞基因表达情况

tumor necrosis factor （TNF），also known as tumor necrosis factor alpha（TNF-alpha, TNF alpha），after stimulation with phorbol myristic acid, myc+。

8.HL-60细胞的推荐接种密度是多少

ATCC 建议在补充有 20% 优质胎牛血清的 IMDM中以 1.0-2.0 x 10 5 个活细胞/ml 的密度接种。这些细胞通常会从冷冻保存中缓慢恢复并作为单细胞悬浮液生长。HL-60细胞在条件培养基中生长良好，只需每 2 或 3 天培养瓶中添加一些新鲜培养基即可。应经常进行细胞计数，以确保细胞密度不超过 1 X 10 6 个细胞/ml。