H1人胚胎干细胞实验操作流程

H1人胚胎干细胞培养准备

一.试剂准备

1)hESC/iPSC培养基配制(500 mL)

1. 在4条件下解冻hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37培养箱/水浴锅解冻。

2. 参考表1在生物安全柜中，使用无菌移液管混匀下列成分配制成hESC/iPSC培养基，之后置于4储存，封口膜封好后2周内使用。

3. 有初培养需扩建的需求，建议先配置100 mL,保证2周内使用完毕。

2)Matrigel铺板(以货号为354277的Corning Matrigel包被6孔板为例)

A. 分装 Matrigel

1. 货号354277的Matrigel，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推荐Dilution Factor为278 μL，则表明278 μL可包被4块6孔板，分装数量=5 mL /0.278=17.98。

2. 准备18个无菌1.5 mL EP管，标记Matrigel日期、操作人;1mL无菌吸头;EP管架，均置于-20冰箱中预冷1小时。

3. 将Matrigel放置4冰箱过夜解冻，当Matrigel解冻即可开始分装。

注：在解冻时，将Matrigel放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。

4. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。

5. 混匀Matrigel，无菌分装于各个1.5 mL EP管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。

6. 将分装后的 Matrigel 置于-20冰箱中保存。

B. 铺板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL离心管中，准备4个6孔板，标记Matrigel、批号、日期和操作人。

2. 1 mL无菌吸头置于-20冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的Matrigel(5mL)置于4冰箱解冻至化冻。

3. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1mL吸头放置于生物安全柜上。

4. 用预冷吸头向解冻过的Matrigel(5mL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反复吹打解冻混匀。

5. 吸出已解冻混匀的Matrigel加入离心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反复吹打混匀。

6. 分装1.5 mL/孔于4个六孔板中，轻轻摇晃混匀。

7. 培养板置于室温1小时后即可使用，或置于4冷藏过夜，两周内使用。

H1人胚胎干细胞培养操作

1)H1人胚胎干细胞复苏步骤(以6孔板为例)

1. 将水浴锅预热至37；并将Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(15~30)。

2. 取4 mL hESC/iPSC培养基，按照1:4000比例加入1 μL的hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温(15~30)。

注意：不要在37水浴锅中预温培养基。

3. 取出1支冷冻的细胞置于37水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将消失时取出。

4. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜;将细胞悬液移到事先准备好的15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入10mL DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。

5. 吸弃上清，加入预温的4 mL的hESC/iPSC培养基+hESC/iPSC Supplement C制备细胞悬液，尽量避免吹打。

注：可留20 μL上清液，轻弹管底，使细胞悬浮液更均匀，避免成较大细胞团。

6. 吸除6孔板中2孔的Matrigel包被液，将细胞悬液按照2 mL/孔接种到1个孔中。

7 水平十字摇匀三次，置于37，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。

8. 18-24小时后换新的hESC/iPSC培养基，之后每天更换培养基。

注：在hESC(H1)培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4mL/孔。

培养容器(孔数)底面积DPBS (mL)EDTA传代工作液hPSC培养基*

2)H1人胚胎干细胞传代步骤(以6孔板为例)

1. 传代条件：① H1人胚胎干细胞汇合度达85%左右(如图1(C-D)所示)，一般情况下每3-4天传代;

② H1人胚胎干细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。

注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。

2. 传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀(如图1(C-D)所示)，建议按照1:8进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例;密度偏高，则增加传代比例。

注：1:8传代就是1个孔瓶传8个孔(以6孔板为例)。

3. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(~25)。

4. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的hESC/iPSC培养基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温(~25)。

5. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(~25)。

6. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的hESC/iPSC培养基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温(~25)。

7. 将孔内培养基吸取，加入2 mL/孔的DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃并吸取。

8. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液覆盖孔底。

9. 置于37培养箱中孵育8-9 min。

注：① 消化8-9 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间;

② 保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。

10. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及时加入2 mL/孔预温的hESC/iPSC培养基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质。

注：① 加hESC/iPSC培养基 + hESC/iPSC Supplement C时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免反复吹打；有部分细胞(10%～15%)未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间(< 10min)。

②hESC(H1)细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution(<15 min)，所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过4孔(六孔板)。

12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入预温的hESC/iPSC培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

13. 在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。

注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤9获得的细胞悬液收集至2mL离心管，轻柔颠倒混匀细胞1-2次;再按照传代比例接种。

14. 接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中， 再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。

15. 18-24小时后更换新hESC/iPSC培养基，此后每天换液，4-5天后继续传代/冻存。

3)H1人胚胎干细胞冻存步骤(以6孔板为例)

1. 当H1人胚胎干细胞汇合度达85%左右(如图1(C-D)所示)可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。

2. 准备相应数量的1.5/2 mL冻存管，标记细胞名称、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出4冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室温预温，使用前注意摇匀。

4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃数次，再吸取。

5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于37培养箱中，计时8-9 min(可参考“六、传代hESC/iPSC"步骤)。

6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。

7. 摇匀预温的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL冻存液，轻柔吹打，水平十字摇匀3次，随后吸取细胞悬液加入1.5/2 mL冻存管中。

8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。

H1人胚胎干细胞培养时需避免的操作失误

1.细胞培养时要规范标准

通常培养细胞时会出现污染等问题很大程度原因是由于我们在培养细胞时操作方法不够标准没有处理好所造成的，因此在培养细胞时需要加强操作规范。

(1)严格控制无菌操作。在培养设备和耗材都准备好以后就要做好日常的消毒工作严格控制细菌、真菌、微生物等常见的污染。如果条件有限的情况下可以在培养基中添加适当的抗生素来防止污染但是这往往会影响到细胞的培养因此要谨慎。

(2)培养环境需要每日观察。特别是很多细胞培养时都会在培养箱中进行，其中温度、适度以及二氧化碳的浓度都会有严格的要求，如果在培养时设备中的环境出现了偏差那么细胞培养时自然会出现问题，因此在培养时应当严格检测好培养设备及环境。

(3)细胞培养基及相关试剂的选择。培养时会用到培养基、血清、试剂等物品但是选择的产品应该是优质产品，劣质的产品往往技术不过关其中包含很多有害物质因此不建议不够。

H1人胚胎干细胞注意事项

1. 收到H1人胚胎干细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，干冰运输的细胞检查干冰是否挥发，细胞是否解冻，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读H1人胚胎干细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

4. 建议客户复苏细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。