磷酸化丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1抗体免疫标记实验注意事项

我公司可提供各种标记物的该抗体:磷酸化丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1抗体Phospho-MKP1(Ser359)免疫标记

包括以下各类:AP ,APC , FITC ,Cy3  ,Cy5  , Biotin , PE-Cy3 ,PE-CY5      Alexa Fluor 350 , Alexa Fluor 488,PE ,HRP,Gold ,  Cy5.5 , Cy7 ,RBITC    , PE-CY5.5 ,PE-CY7,Alexa Fluor 555 。Alexa Fluor 594,Alexa Fluor 647等标记类,更多详询。

【规        格】:50ul/100ul/200ul(更大包装可详询)

【浓        度】:1mg/1ml

【抗体来源】:Mouse,Rabbit or Goat 

【交叉反应】:咨询客服

【产品类型】:一抗 

【性        状】:咨询客服

【纯化方法】:affinity purified by Protein A

【储 存 液】:0.01M PBS, pH 7.4 with 10 mg/ml BSA and 0.1% Sodium azide

【产品应用】:not yet tested in other applications.optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user.【保存条件】Store at -20 °C for one year. Avoid 【保存条件】repeated freeze/thaw cycles. The lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater than a year when kept at -20°C. When reconstituted in sterile pH 7.4 0.01M PBS or diluent of antibody the antibody is stable for at least two weeks at 2-4 °C.

磷酸化丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1抗体Phospho-MKP1(Ser359)免疫标记,Western Blot抗体杂交:

孵育一抗

A. 先将需要检测的抗体准备好,并决定好它们的稀释度。

B. 配好5%的Milk(TBST溶解),按要求稀释好抗体。注意,如需高比例稀释,采用梯度稀释。

C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。 一般采用RT 1小时,可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。

注意:为了便于后面分析结果,我们一般会选用已确定分子量大小

磷酸化丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1抗体Phospho-MKP1(Ser359)免疫标记  免疫组化实验操作步骤(以石蜡切片为例)

仪器、设备:

移液枪、免疫组化笔、水浴锅、计时器、孵育湿盒、切片架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶等。

操作步骤

1.脱蜡水化。将石蜡切片置于新鲜二甲苯脱中浸泡 15 分钟,重复三次。去除多余的液体后,依次置于无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇,各浸泡 5 分钟,蒸馏水(或自来水)冲洗 5 分钟。用 PBS 缓冲液(试剂 1,将干粉溶解于 1L 去离子水中)冲洗切片 5 分钟,重复三次。

2.抗原修复。将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯(或修复盒)中的耐高温塑料切片架上,加适量修复液 1× 柠檬酸钠抗原修复液(试剂 2,将 100×柠檬酸钠抗原修复液加去离子水稀释成 1×柠檬酸钠抗原修复液),液面要浸过切片组织一定高度,将修复盒置于沸水中煮沸修复 15 分钟后取出玻片,自然凉至室温。用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟,重复三次。

注意:抗原修复时,修复液务必保证切片始终浸泡在液体内,一般情况:修复液的量约为 800mL/1 架。

3.阻断内源性过氧化物酶。用吸水纸擦干玻片,免疫组化笔在组织周围画圈,滴加 50μL 内源性过氧化物酶阻断剂(试剂 3)到切片组织上以阻断内源性过氧化物酶,室温孵育 30 分钟,用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟,重复三次。

4.血清封闭。用吸水纸擦干玻片,滴加 50μL 正常山羊血清工作液(试剂 5),37℃封闭 20 分钟,以减少非特异性染色。

5.一抗孵育。用抗体稀释液(试剂 4)将一抗原液稀释成工作液,用吸水纸擦干玻片组织周围的液体,滴加适量抗体工作液,置于湿盒 4℃孵育过夜或 37℃孵育 1h-2h。

6.复温。4℃过夜后从冰箱拿出样本,在室温下孵育 15min 复温(抗体孵育为 4℃过夜选用此步骤,如室温孵育直接进入下一步清洗)。用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟,重复三次。

7.二抗孵育。吸水纸擦干切片后滴加 50μL 生物素标记的羊抗兔 IgG(试剂 6),37℃孵育 20  分钟,用 PBS缓冲液冲洗切片 5 分钟,重复三次。

8.三抗孵育。吸水纸擦干切片后滴加 50μL 辣根酶标记的链酶卵白素孵育(试剂 7),37℃孵育 20  分钟,用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟,重复三次。

9.显色。甩去 PBS 缓冲液,吸水纸擦干切片; 每张切片滴加新鲜配制的 DAB 工作液 50μL(试剂 8:试剂 9:试剂 1=1:1:18  比例配置),孵育 3-5min,光学显微镜下观察染色结果,切勿显色过深;显色后用自来水冲洗切片终止显色。

10.复染。滴加适量苏木素染液(试剂 10)复染,孵育 1-5 分钟,自来水冲洗 5 分钟,滴加盐酸酒精分化液分化 30 秒,自来水冲洗。

11.脱水封片。将玻片依次置于 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇,各浸泡 5 分钟, 再将玻片放入二甲苯中浸泡 15 分钟,重复三次。玻片取出来稍晾干,用中性树胶封片。

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