原代细胞大鼠甲状旁腺细胞的分离培养

甲状旁腺是哺乳动物体内分泌腺之一，有两对，棕黄色，分别位于左右两叶甲状腺背面的中部和下部，其主要功能为分泌甲状旁腺激素，调节体内钙、磷的代谢。甲状旁腺功能减退症是指甲状旁腺激素分泌减少或功能障碍的一种临床综合症。

甲状旁腺细胞来源于实验动物的正常甲状旁腺组织，形态多为梭形，多角形细胞，贴壁培养生长，通过PTH免疫荧光染色鉴定为阳性，细胞的纯度高于90%，不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

甲状旁腺细胞分离培养试验所需仪器设备及试剂

（1）仪器

（2）试剂耗材

2．大鼠甲状旁腺细胞的分离培养的步骤：

1、首先将4-6周的SD大鼠进行麻醉，在无菌条件下，取下甲状旁腺组织，然后放入75%酒精中浸泡3-5分钟。
2、然后在体视显微镜下仔细去除包膜、血管及结缔组织等杂质。
3、将剩下组织清洗并剪碎。
4、将剪碎的组织置于0.1% 胶原酶Ⅰ与胶原酶 Ⅳ中消化1-2小时。
5、终止消化后，过100μm滤网。
6、收集滤液后，300g离心5分钟。
7、重悬沉淀，铺瓶。
3、免疫荧光鉴定的步骤

（1）细胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。
（2）固定
细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。
（3）破膜封闭
将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，
玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，
取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。
（4）一抗孵育
一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释
破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（最多可放置一周）
（5）二抗孵育
室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。
鉴定的细胞为P1代细胞