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小鼠胚胎成纤维细胞分离、培养及鉴定教程

更新时间:2024-11-22      点击次数:57

小鼠胚胎成纤维细胞分离、培养及鉴定教程


一:细胞简介

小鼠胚胎成年维细胞常用作ES细胞培养常用的饲养层细胞,能产生抑制ES细胞自主分化和促进ES细胞增殖的因子,故能有效地促进ES细胞的增殖井维持其示分化特性和多潜能性,

且分泌效果优于外源添加的一些因子而且可以为ES细胞的培养提供类似于体内的微环境故在研究哺彩L动物ES细胞中得到广泛使用。


二:实验准备

提前准备好将要用到的工具、试剂:无菌枪头、无菌EP管、小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基、胚胎成纤维细胞组织分离液、胚胎成纤维细胞

基础培养基、HBSS缓冲液。


三:实验步骤

取孕13.5天小鼠,断颈处死,置于体积分数为75%酒精消毒3 min无菌打开孕鼠腹腔可见腹腔两侧呈“V"字型串珠样子宫。用镊子提起子宫(

注意:不能碰到皮毛,以防污杂)并用眼科剪去除子宫系膜和结缔组织,将子宫放入含有HBSS的一次性无菌培养皿中漂洗两三遍去除淤血,

用眼科剪和镊子去除胎盘、手膜等胚胎外组织,取出胚胎放入另一平皿用HBSS洗涤,直到没有血迹为止。用眼科剪和镊子去除胚胎的头部、

四肢及内脏,留取躯干部(头部、四肢及内脏需去除干净)将躯干部放入玻璃平皿中用HBSS洗涤1次,用眼科剪将胚胎躯干部剪碎成糊状加入

5mL HBSS混勿移入离心管中,自然沉降3min后将上清液轻轻吸出弃掉加入3mL 组织分离液轻轻吹打后室温下自然沉降2min,

将上清液轻轻吸出弃掉加入3mL 组织分离液轻轻吹打后室温下消化3min,将上部的单细胞悬液轻轻吸出放入另一个离心管中加等量小鼠胚胎

成纤维细胞专用培养基终止消化,重复消化两次若还有未消化的组织再加入2 mL组织分离液轻轻吹打至消化。终止消化,

混匀离心管收集所有细胞悬液自然沉降1min,将大块沉淀吸出弃掉800转每分钟离心5mi弃去上清,

使用小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基重悬至5 mL吸取细胞溶液,加入台盼蓝进行计数按5x106/瓶接种到T25培养瓶中补足体积分数为小鼠

胚胎成纤维细胞专用培养基记为原代(PO)摇晃混匀,在37℃、体积分数为5%二氧化碳的培养箱中培养,24h后换液。


细胞鉴定

24h后可见绝大部分贴壁细胞呈成纤维细胞样,细胞体积较小,杂细胞较少,30min细胞贴壁,其中部分开始伸出伪足,表现为小的突起,6h后细胞基本贴壁,伸展成梭形,胞核清晰,分布较均匀,散在生长,不聚集成团;分布较均匀,散在生长,不聚集成团,细胞生长迅速,

5-7天即呈融合状态,细胞排列紧密,有的交叉重叠生长,平坦、胞体较大,细胞质透明,细胞核较大,呈椭圆形,颜色淡,细胞融合,

并彼此连接成网状,细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布,细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分

布,小鼠胚胎成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定纯度可达90%以上


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