口蹄疫O型抗体检测试剂盒（酶联免疫法）原理与操作指南

口蹄疫O型抗体检测试剂盒（酶联免疫法）

【产品名称】

通用名：口蹄疫O型抗体检测试剂盒（酶联免疫法）

英文名：Test Kit for Antibodies to Foot and Mouth Disease Virus Asia O（ELISA）

【包装规格】 96T×1/盒、96T×2/盒、96T×5/盒

【预期用途】 口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，其特征为口腔黏膜、蹄部、乳房皮肤发生水泡和烂斑。

本试剂用于检测牛、羊、猪血清中口蹄疫O型抗体，可用于口蹄疫O型疫苗免疫效果评价。

【原    理】

   本试剂盒由预包被口蹄疫O型抗体的酶标板、抗体工作液、抗原液、酶标记物及其他配套试剂组成，应用阻断酶联免疫法（ELISA）原理检测牛、羊、猪血清样本中口蹄疫O型抗体。实验时将稀释的样本与抗原液同时加入酶标板中孵育，样本中的抗体与酶标板上的抗体竞争抗原，阻断抗原与板的结合；经洗涤后，再加抗体工作液孵育；经洗涤后加入酶标记物孵育；再经洗涤除去未结合的酶标记物，在孔中加底物液，与酶标结合物反应形成蓝色产物，显色深浅与样品中的特异性抗体含量成负相关；加入终止液终止反应后，产物变为黄色；用酶标仪在450nm波长测定各反应孔中的吸光值，即可知样品是否含有口蹄疫O型抗体。

【试剂盒组成】

【储存及有效期】 2～8℃保存，有效期12个月。

包被板开封后请于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限为2个月。

【适用仪器】 含450nm、630nm波长的酶标仪，37℃恒温设备，可调微量移液器。

【样品准备】

1.取动物全血按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血、无污染。样品1周内可于2～8℃保存，长期需置-20℃保存。

2.用工作洗涤液将待检牛、羊血清先按32倍稀释（如5μl血清加入155μl工作洗涤液中，混匀），待检猪血清按16倍稀释（如5μl血清加入75μl洗涤液中，混匀），阴、阳性对照不用稀释。

3.浓缩洗涤液使用前应恢复至室温使沉淀溶解，然后用蒸馏水或去离子水作20倍稀释成工作洗涤液(如19份蒸馏水或去离子水+1份浓缩洗涤液)。

【检验方法】

1.使用前将试剂盒置室温30分钟，恢复至室温。

2.取所需用量酶标板条，设阴性/阳性对照各2孔，未用的板条尽快密封，2～8℃保存。

3.阴、阳性对照孔分别加入阴、阳性对照50μl，样品孔每孔先加入工作洗涤液25μl，再加入稀释后的样品25μl；最后都加入抗原液50μl。

 注：加入抗原后牛、羊样本稀释比例相当于1:128，猪样本稀释比例相当于1:64。

4.震荡混匀10秒，盖好盖板膜，置37℃（推荐水浴）避光反应30分钟。

5.甩去孔内液体，每孔加350μl工作洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，最后一次拍干。

6.每孔加抗体工作液50μl，盖好盖板膜，置37℃避光反应30分钟。

7.洗涤，同步骤5。

8.每孔加酶标记物50μl，盖好盖板膜，置37℃避光反应30分钟。

9.洗涤，同步骤5。

10.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混匀，盖好盖板膜，置37℃避光反应15分钟

11.每孔加终止液50μl，混匀，于450nm(可用630nm作参比波长）测定各孔吸光值（A值）。

【参考值】 实验正常的情况下，阴性对照A值≥0.8，阳性对照A值≤50%×阴性对照A值。

【检验结果的解释】

1.PI（阻断率）=（1- 阴性对照平均A值(样本A值)）×100%，PI≥50%为阳性；PI＜50%为阴性。

2.本实验检测牛、羊血清结果为阳性时表明待检样本中含有口蹄疫O型抗体，且效价高于1:128，达到保护水平；反之检测结果为阴性时表明待检样本中不含有口蹄疫O型抗体，或效价低于1:128，未达到充足保护水平。

3.本实验检测猪血清结果为阳性时表明待检样本中含有口蹄疫O型抗体，且效价高于1:64，达到保护水平；反之检测结果为阴性时表明待检样本中不含有口蹄疫O型抗体，或效价低于1:64，未达到充足保护水平。

4.如需了解样本抗体的最终效价，可将样本进行梯度稀释，使PI≥50%的最高稀释比例即为该样本抗体的最终效价。

【试验方法的局限性】

该试验仅作为定性牛、羊、猪血清中口蹄疫O型抗体，根据PI值高低可作抗体水平强、中、弱的粗略评估。

该试剂盒不适用于合成肽疫苗免疫抗体效价评估。

【注意事项】

1.实验操作时需戴手套、穿工作衣，严格健全和执行消毒隔离制度，各种实验废弃物都应按传染物处理。

2.终止液具有腐蚀性，应避免接触皮肤和衣物，如不慎接触请立即用大量自来水冲洗。

3.酶标板从冷藏环境中取出时应恢复至室温方可开袋，未用完的酶标板需放入有干燥剂的密封袋中保存。

4.浓缩洗涤液在低温时容易结晶，使用时需恢复至室温以溶解。

5.洗涤时各孔均需加满液体，防止孔口有游离酶不能洗净。

6.用于检测的样品应保持新鲜。

7.试验结果的判定必须以酶标仪读数为准。

8.不同批号试剂组分不得混用。