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免疫荧光染色封片技巧

更新时间:2024-07-17      点击次数:212

免疫荧光染色是实验室常用的技术之一,但在操作过程中,有许多需要注意的细节,任何一个环节的失误都可能导致实验失败。本文将为您介绍免疫荧光染色的注意事项。




1. 抗体选择:选择针对您研究的目标蛋白特异性高、亲和力强的抗体,一抗的浓度需要预实验摸索。一抗浓度过高(本身荧光实验,一抗的浓度就较高),也是造成自发荧光强的重要原因。




2. 抗体稀释:根据抗体说明书建议,使用合适的稀释液和稀释比例进行抗体稀释。




3. Blocking:使用合适的Blocking 液进行Blocking 处理,以减少非特异性结合,一般采用动物血清,在室温下封闭1h左右。建议适当延长封闭的时间至2h。如果室温较低,可以考虑采用37℃孵育箱进行封闭,优化封闭时间,充分去除组织中的类属抗原。




4. 二抗选择:选择与一抗种属匹配的荧光标记二抗,二抗在4℃长时间放置后可能有部分荧光素沉淀,导致染色结果有星星点点的杂质,损失珍贵样本!建议配成工作液后,高速离心,取上清使用。




5. 洗涤:在每一步操作后,充分洗涤以去除未结合的抗体和染料。




6. 封片:选择合适的封片剂进行封片,避免荧光淬灭。




7. 对照设置:设置合适的阳性和阴性对照,以确保实验结果的可靠性。





封片技巧:



在滴加封片剂之前,确保切片上没有多余的液体。封片剂也不宜添加过多,可用10ul枪头吸取少量,点在每个样品边缘,缓慢盖片。




滴加适量的封片剂,避免产生气泡。


用10ul枪头滴加~5ul/样品(根据组化笔大小 酌情更改封片剂滴加量) 千万不可打出气泡!不要把枪头最后一滴封片剂打出!气泡会严重影响封片效果!


如果不小心产生气泡 → 可以用镊子轻轻将气泡挤出。




使用干净的盖玻片,轻轻按压,使封片剂均匀覆盖切片。




避免在盖玻片上留下指纹或污渍。


希望 这些技巧能帮助您顺利完成实验。


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