培养NK-92/NK-92MI细胞时要注意什么？

NK-92细胞，是从外周血单核细胞衍生来的、IL-2依赖型NK细胞株。

NK-92MI细胞，源自NK-92细胞的IL-2非依赖的NK细胞株。

亲本细胞NK-92通过微粒体基因转化法，用逆转录病毒MFG-hIL-2载体携带的人IL-2cDNA进行转化。

作为同源细胞，NK-92与NK-92MI细胞存在诸多共性，但二者在培养方式及注意事项上也不尽相同。

下面，小普将为同学们详细阐释，NK-92MI与NK-92细胞的收货以及培养注意事项。

01

细胞收货注意事项

除NK-92 细胞在分瓶后需添加IL-2之外，NK-92MI与NK-92细胞在收货处理上，方法大致相同。具体操作如下：

细胞刚收到后，将细胞培养瓶先竖立静置2~4个小时，让细胞沉降到底部；

大细胞静置完后，将瓶中上面部分培养基小心吸出，留底部细胞和3ml左右培养基在原瓶；

吸出的细胞培养基离心收集细胞沉淀，离心转速1000转3分钟，或根据您的离心机实际情况而定，转速不宜过高；

将得到的细胞沉淀，用2~3ml NK-92/NK-92MI完培重悬后，放回原瓶继续培养过夜，一个T25最终培养体积是5~6毫升；

NK-92细胞可按照200 U/ml的浓度补加一点IL-2，因为原瓶留的培养基IL-2可能已部分失效，NK-92MI细胞则不需要额外补加IL-2。

出厂的培养瓶为不透气瓶盖，一定要拧松到不掉的程度，使细胞充分透气；

培养瓶横放，瓶口拧松透气，培养过夜；

第二天，视细胞密度和培养基消耗情况，进行分瓶。不建议直接进行离心操作，因为经过运输颠簸和各种处理，细胞很可能达不到状态。尽量不要吹散细胞团，加完液轻晃培养瓶即可。

02

细胞培养注意事项

NK-92MI与NK-92细胞同源，在培养方法上也有很多共同之处。但由于两者对IL-2敏感程度不一，培养操作时略有差别。具体步骤如下：

NK-92与NK-92MI细胞都为悬浮生长，大部分细胞聚集成团，少数细胞分散，并且细胞间隙会有较多的死细胞和细胞碎片；

NK-92细胞对IL-2敏感。培养基中IL-2降解，将导致细胞状态变差。IL-2在-20℃解冻后置于4℃冰箱保存，4℃保存不应超过两周。配制好的新鲜培养基要尽快用完，建议每次使用前拿出来常温预热，不要放培养箱预热，使用完毕后放回4℃冰箱保存；

实验室常备IL-2，发现细胞状态不好、散在细胞变多、细胞不生长等情况，以200 U/ml的浓度添加IL-2，培养2-3天后即可恢复状态；

NK-92MI细胞虽然对IL-2不敏感，正常培养不需要补加IL-2，但如果发现细胞状态不太好，散在细胞变多，细胞不生长等情况，也可以以200U/ml的浓度补加IL-2，培养2-3天后状态会有改善。

NK-92与NK-92MI细胞都对离心敏感。正常培养时，换液周期为2~3天，建议交替使用半量换液和离心换液法，即半量换液2~3次后，离心全量换液一次。尽量减少离心次数，细胞状态不佳或细胞量少的时候，一般不建议离心；

换液方法：

▶ 补液法：每2~3天补加适量（根据培养容器和原来细胞悬液体积来定，T25瓶一次补液1~2毫升即可）新鲜培养基（NK-92需要同时补加200 U/ml IL-2，而NK-92MI则不需要），补加2-3次之后，离心全部换液。

▶ 半换液法：以T25瓶子（瓶中装有5ml培养基）为例，竖起瓶子静置一段时间（竖瓶前轻拍培瓶，让轻贴底部的细胞团浮起来），待细胞沉底（肉眼观察细胞沉底情况），小心吸出2.5ml上清转移到离心管，离心1000rpm 3~5min，离心后的细沉淀用2.5ml新鲜培养重悬后放回原瓶继续培养。

细胞生长时，聚集的细胞团会逐渐增大，正常的细胞团在显微镜下呈现白色透亮状。若细胞聚集太多，出现细胞团中部发暗时，可传代；

传代方法：

▶ 将细胞团用移液器轻轻吹散（一般吹2-3次即可，吹打力度不可过大，否则会出现大量死细胞和细胞碎片），均分到两个瓶子里，每瓶再补充等量培养基。

细胞对营养要求很高，千万不能团块太大，这会导致营养不足；细胞团块过大时，需要稍微吹散，注意控制吹打次数，不需要全部吹散。

03

细胞冻存

推荐使用90%FBS+10%DMSO的冻存液配比，NK-92细胞可适量补加IL-2，NK-92MI无需添加；

细胞冻存的时候，尽量吹散细胞，注意控制吹打力度。

04

细胞复苏

NK-92MI与NK-92细胞的复苏培养方法相同，操作步骤如下：

复苏后，用5ml新鲜培养基，重悬细胞；

瓶子竖着（瓶盖朝上）放进培养箱，以增加细胞局部密度，瓶盖保持透气；

细胞生长需要稳定的环境，可每天观察1次，不要频繁拿出培养箱观察；

每3天补液一次，补充1-2ml新鲜培养基即可，补加1-2次之后半量换液，不要频繁离心；

观察到培养基明显变黄，细胞团块明显变大后可以分瓶，一次传代最多分一瓶同等大小培养瓶。

05

 细胞团块是否需要吹散

减少离心次数，控制传代时的吹打次数。团块需要吹散，但不用刻意吹散成单颗；

正常传代或者离心换液后吹打，控制吹打次数以及力度，即使细胞都分散成单个，也会在1~2天内聚集起来；

细胞团太大时，需要分散；

细胞冻存的时候，细胞需要尽量分散，否则影响冻存效果。