引物设计和末端标记实验

试剂、试剂盒激酶缓冲液MgCl2二硫苏糖醇牛血清白蛋白ddH20TE 缓冲液EDTA聚核苷酸激酶引物放射性化合物

仪器、耗材放射性化合物离心机和转子丙烯酸防护板离心管架废弃物容器盖革计数器QuickSpin 柱

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

5X 激酶缓冲液

0.25mol/LTris-HCl,pH9

0.05mol/LMgCl2

0.05mol/L 二硫苏糖醇（DTT)

0.25 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA)

-20°C 储存

灭菌重蒸水（ddH20)

TE 缓冲液，pH8.0

10 mmol/LTris-HCl,pH8.0

1mmol/LEDTA，pH8.0

2. 酶和酶缓冲液

聚核苷酸激酶，10U/ul(Roche)

3. 核酸和寡核苷酸

寡核苷酸引物

4. 放射性化合物

[y-32P]ATP6000Ci/mmol/L(lCi=3.7X1010Bq)(PerkinElmerLifeSciences)

也可用 [y-33P]ATP, 它相对于 [y-32P]ATP 危险性稍微小一些，并具有更长的半衰期，但是更贵。

5. 离心机和转子

用翻转吊桶式转子离心，15 ml 锥形管的适配器

6. 专用设备

丙烯酸防护板、离心管架（「betablock」）和废弃物容器

离心管架（例如 3008-1000fromUSAScientific)

收集管（1.5 ml，包括快速离心柱）

冷却块（coolingblock)

锥形管，15 ml

盖革计数器（Geigercounter,—种放射能测定器）

离心管，0.5 ml，灭过菌

QuickSpin 柱（TE：),G-25 葡聚糖凝胶（Sephadex) 柱，用于放射性标记 DNA 的纯化(Roche)

水浴

二、方法

1. 用灭菌 ddH20 将引物稀释至10umol/L。所购买的引物是以 50nmol/L 等级合成的收到时呈冻干粉状。用 PH8.0 的 TE 缓冲液将干粉溶解后，作为储存液保存。使用前将其稀释成 10umol/L 的工作溶液，分装成小份，冻存于-20°C。

2. 选择一个引物进行末端标记。在冰上融化引物和 5X 激酶缓冲液。酶在加入反应体之前都要放在冰柜里，也可以用台式冷却块使酶维持在-20°C。在室温下融化同位素，需将丙烯酸防护板挡在前面。

3. 在冰上将 3ul 灭菌 ddH20、5.6ul5X 激酶缓冲液、12ul 10mol/L 引物和 1.4ul 聚苷酸激酶加入到灭菌的 0.5 ml 离心管中，将冰盒放在丙烯酸防护板后面，加入 6ul[y-32P] ATP(6000Ci/mmol/L)。混匀，盖上盖子，37°C 水浴上温育 1~2 h。

4. 在温育的最后 10min 准备 QuickSpin 柱。将柱子反复颠倒混匀，除去管帽和顶盖放入收集管内。将柱子/收集管组件置于 15 ml 锥形管中，在台式离心机中以 1100 g 离心2 min。倒干收集管再离心一次。在装入末端标记的反应混合物之前，转移柱到另一干净的收集管中。

5. 温育完成之后，将末端标记反应混合物在离心机上短暂离心。加入 52ul 灭菌 ddH20,移液器吹打混匀，转移所有溶液到离心柱上纯化（比如除去未利用的核苷酸)。

6.1100 g 离心 4 min。

7. 从收集管上将柱子取下，并扔入适当的放射性废弃物容器中。盖上收集末端标记物的收集管的盖子。继续 PCR 方案（方案 2) 或将引物放在试管架上于-20°C 冻存。