细胞传代实验的操作步骤

实验原理

培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。

实验材料 细胞

试剂、试剂盒 D-Hanks液、小牛血清、RPMI1640、双抗、胰蛋白酶、EDTA、NHCl、NaHCO3

仪器、耗材 净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱、倒置相差显微镜、培养箱、吸管、玻璃瓶、培养瓶、吸头、枪头、胶塞、离心管、量加样枪、废液缸、红血球计数板

实验步骤

1.  贴壁细胞的消化法传代：

（1）吸除或倒掉瓶内旧培养液。

（2）D-Hanks液洗2～3次。

（3）向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。

（4）然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液，轻轻摇动再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化（也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化）。

（5）消化最好在37℃或室温25℃以上环境下进行。

（6）消化2～5 min 后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。

（7）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉。

（8）再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。

（9）用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行。

（10）从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。  

（11） 计数，分别接种在新的培养瓶内。

2.  悬浮细胞的传代：悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。

离心传代法：

（1） 将细胞连同培养液一并转移到15 ml 离心管内。

（2） 离心800~1000 rpm，5 min。

（3） 弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液。

（4） 计数，分别接种在新的培养瓶内。 

（5）直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。

3.  部分贴壁细胞的传代

（1）部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。

（2）对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后，才能吹打传代。

注意事项

1.  胰蛋白酶要预温，温度37℃左右为宜℃。

2.  离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。

3.  要定时观察细胞，发现污染，应及时处理。

发布人：上海雅吉生物科技有限公司