ELISA实验——原理、步骤

ELISA实验——原理、步骤

一、实验目的

1. 检测生物样品中抗体、抗原、蛋白质和糖蛋白等物质的含量。

2. 药物药效学评价、筛选。

二、ELISA实验原理

免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是免疫学和分子生物学中广泛使用的实验室技术，

由Eva Engvall和 Peter Perlmann 于1971年描述。

这一方法的基本原理是：

①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本

（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的

抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，

底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析

。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度

三、ELISA实验步骤

1. 样品准备

a. 细胞上清样品，需将培养瓶内的细胞消化离心取上清即可（如800g，5分钟）。

b. 血清样品，将全血收集至不含抗凝剂的试管内，在室温下放置1小时，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1500g离心10分钟

，取黄色上清即得血清。

c. 血浆样品，将全血收集至含抗凝剂的试管内，混匀后置冰上，4℃约1500g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆。

2. 确定样品测试组、标准品和空白组组所需的微孔条数量，每个浓度做两个平行重复，从支架上取出对应数量的微孔条，剩余储存在

箔袋中，密封后在4℃储存。

3. 配制对应浓度的捕获抗体溶液、检测抗体溶液、包被液、洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液、链霉亲和素-HRP

（若使用试剂盒则没有此步骤或按试剂盒要求配制）。

4. 每孔加入100μL 捕获抗体溶液，用封板膜覆盖，4℃孵育过夜，过夜后舍弃舍板内溶液。

5. 每孔加入300-400μL洗涤液清洗五次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干（若使用试剂盒则没有步骤4和5）。

6. 用样品稀释液按照1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:2000稀释样品，以此确定样品IL-2的最佳检测浓度。

7. 配制梯度浓度的IL-2蛋白标准品，将工作浓度设置为1200pg/mL, 600pg/mL, 300pg/mL, 150pg/mL, 75pg/mL, 37.5pg/mL,

18.75pg/mL，9.38pg/mL，以此浓度来绘制标准曲线。

8. 分别将样品、标准品、样品稀释液按照100μL/孔加入相应孔中作为标测试组、标准品组、空白组。

9. 将偶联生物素的抗人IL-2抗体按照50μL/孔加入所有孔中，用封板膜覆盖，室温避光孵育2小时。

10. 每孔加入300-400μL洗涤液洗板五次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。

11. 在所有孔加入100μL稀释后的链霉亲和素-HRP，用封板膜覆盖，室温避光孵育1小时。

12. 每孔加入300-400μL洗涤液洗板五次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。

13. 在所有孔中加入100μL TMB显色液。用封板膜覆盖，室温避光孵育30min。

14. 在所有孔中加入终止液50μL，混匀后立即测量A450值。

15. 计算每一组重复的标准品和样品的平均吸光度值。重复次数应在平均值的20%以内。

16. 绘制IL-2标准品标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。

通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。

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